Analysis of the genetic network regulating the number of flowers in the secondary inflorescence of legumes

Abstract

[ES] En las leguminosas, la inflorescencia presenta una arquitectura de racimo compuesto en la que la inflorescencia primaria (I1) origina inflorescencias secundarias (I2), responsables de producir las flores que darán lugar a vainas y semillas. El número de flores por I2 es un carácter de gran relevancia agronómica, ya que determina la capacidad reproductiva y, por tanto, el rendimiento del cultivo. Sin embargo, los mecanismos genéticos que controlan este rasgo siguen siendo poco conocidos. El gen SFL/CaRAX1/2a de garbanzo (Cicer arietinum) fue el primero identificado como regulador del número de flores por I2 y se corresponde con los genes RAX1 y RAX2 de Arabidopsis, que codifican factores de transcripción de la familia R2R3-MYB implicados en la activación de meristemos axilares y florales. En este trabajo demostramos que el gen PsRAX1/2a de guisante (Pisum sativum) conserva la función de SFL/CaRAX1/2a, actuando como represor de la actividad del meristemo I2. Esto evidencia una conservación funcional entre leguminosas, junto con una diversificación evolutiva respecto a especies con inflorescencias simples, como Arabidopsis. Asimismo, el gen homólogo PsRAX1/2b también limita la actividad del meristemo I2. Las plantas mutantes psraxb-1 presentan un aumento en el número de flores por I2 acompañado de una flor terminal anómala y un fenotipo pleiotrópico que afecta a la regulación de la inflorescencia y la ramificación. Nuestros resultados sugieren que PsRAX1/2b participa en la formación de límites entre el meristemo I2 y los meristemos I1 y floral; su pérdida compromete la identidad del I2 y conduce a la aparición de flores terminales anómalas y estructuras vegetativas. Aunque los tres homólogos de guisante (PsRAX1/2a, PsRAX1/2b y PsRAX1/2c) se expresan en yemas axilares, solo existe mutante para PsRAX1/2b, que muestra ausencia total de ramificación, indicando un papel adicional en la activación de meristemos axilares, posiblemente redundante con sus homólogos, como ocurre en Arabidopsis. El análisis de genotipos multipod reveló que el número de flores por I2 está regulado por al menos cuatro genes: PsRAX1/2a (cromosoma 7), PsRAX1/2b (cromosoma 5), Fn (cromosoma 6) y Fna, junto con Neptune (cromosoma 4). También mostró que este carácter es altamente sensible a factores ambientales. Temperaturas bajas (18°C) y fotoperiodos de día corto prolongan la actividad del meristemo I2 y favorecen la formación de más flores, tanto en líneas multipod como en genotipos de 1-2 flores, aunque con respuestas dependientes del genotipo. Esto indica la existencia de rutas genéticas distintas y resalta la importancia de la plasticidad ambiental en el desarrollo de la inflorescencia. Esta influencia ambiental también se observó en el silenciamiento por VIGS de PsRAX1/2a, donde el fenotipo de doble flor mostró mayor expresividad bajo día corto y 21°C. Finalmente, el análisis comparativo en soja resolvió la controversia sobre su arquitectura inflorescente, demostrando que presenta un racimo compuesto y que la red genética que define la identidad de los meristemos (I1, I2 y floral) está conservada respecto a guisante y Medicago. En particular, Dt2/GmFULc2 desempeña un papel equivalente al de VEG1/PsFULc en la especificación del meristemo I2. En conjunto, estos resultados muestran que la regulación de la actividad del meristemo I2 en leguminosas depende de un sistema poligénico con adaptaciones específicas que generan divergencia funcional y una marcada respuesta al ambiente. Esta visión integradora proporciona un marco conceptual para comprender la regulación del número de flores por I2 y sienta las bases para estrategias de mejora orientadas a optimizar el rendimiento en cultivos de leguminosas.

[EN] In legumes, the inflorescence displays a compound raceme architecture in which the primary inflorescence (I1) gives rise to secondary inflorescences (I2) that produce the flowers, which subsequently develop into pods and seeds. The number of flowers per I2 is a trait potentially of major agronomic relevance, as it determines the reproductive capacity of the plant and, consequently, its yield. However, despite its importance, little is known about the genes controlling this trait. The chickpea (Cicer arietinum) gene SFL/CaRAX1/2a was the first and only gene identified as regulating the number of flowers per I2. It ishomologous to Arabidopsis RAX1 and RAX2 genes, which encode R2R3-MYB transcription factors involved in axillary meristem initiation and floral meristem formation. In this work, we show that the pea (Pisum sativum) gene PsRAX1/2a conserves the function of SFL/CaRAX1/2a, acting as a repressor of I2 meristem activity. This reveals functional conservation among related legumes, while also highlighting evolutionary diversification relative to more distantly related species such as Arabidopsis, whose inflorescence is simple and lacks secondary branching. Similarly, the homologous PsRAX1/2b gene also restricts I2 meristem activity. Mutant psraxb-1 plants exhibit an increased number of flowers per I2, always accompanied by an anomalous terminal flower. Mutation of PsRAX1/2b results in a pleiotropic phenotype affecting inflorescence regulation and also branching. Our data suggest that PsRAX1/2b contributes to the establishment of boundaries between the I2 meristem and the adjacent I1 and floral meristems. In its absence, these stablisment of these boundaries would be lost, compromising I2 identity and leading to the formation of terminal floral anomalies and I2s with vegetative structures such as leaves or bracts. Although the three pea homologs (PsRAX1/2a, PsRAX1/2b, PsRAX1/2c) are expressed in axillary buds, only a mutant for PsRAX1/2b is available, which shows a complete absence of branching, indicating that PsRAX1/2b also plays an activating role in axillary meristems, perhaps redundantly with its homologs, as observed for RAX genes in Arabidopsis. Analysis of multipod genotypes revealed that the number of flowers per I2 in pea is regulated by at least four distinct genes: PsRAX1/2a on chromosome 7, PsRAX1/2b on chromosome 5, Fn on chromosome 6, and Fna together with Neptune on chromosome 4. It also showed that the multipod phenotype is highly sensitive to environmental factors. Thus, the number of flowers per I2 is a polygenic trait strongly conditioned by genotype-environment interactions. Low temperatures (18°C) and short-day photoperiods prolong I2 meristem activity and promote the formation of additional flowers in both multipod lines and 1-2-flower genotypes, although with genotype-specific responses. This suggests the existence of distinct genetic pathways and highlights the importance of environmental plasticity in inflorescence development. Environmental influence was also evident in PsRAX1/2a-VIGS silencing, where under short-day conditions and 21°C, the double-flower phenotype showed greater expressivity and penetrance. Finally, comparative analysis in soybean resolves the long-standing controversy regarding its inflorescence architecture, demonstrating that it consists of a compound raceme and that the genetic network defining meristem identities (I1, I2, and floral) is most likely conserved regarding to pea and Medicago. In particular, it indicates that Dt2/GmFULc2 performs a role equivalent to that of the pea gene VEG1/PsFULc in specifying I2 meristem identity. Together, these results show that regulation of I2 meristem activity in legumes relies on a polygenic system with species-specific adaptations that generate functional divergence and environmental responsiveness. This integrative framework advances our understanding of the genetic control of I2 meristem activity and flower number, and provides a fou

[CA] En les lleguminoses, la inflorescència presenta una arquitectura de raïm compost en què la inflorescència primària (I1) origina inflorescències secundàries (I2) que produeixen les flors, les quals formaran posteriorment beines i llavors. El nombre de flors per I2 és un caràcter de gran rellevància agronòmica, ja que determina la capacitat reproductiva de la planta i, en conseqüència, el rendiment. Tot i això, encara es coneixen pocs detalls sobre els gens que regulen aquest tret. El gen SFL/CaRAX1/2a de cigró (Cicer arietinum) fou el primer identificat com a determinant del nombre de flors per I2 i és homòleg dels gens RAX1 i RAX2 d'Arabidopsis, que codifiquen factors de transcripció R2R3-MYB implicats en l'activació dels meristems axil·lars i en la formació dels meristems florals. En aquest treball mostrem que el gen PsRAX1/2a de pèsol (Pisum sativum) conserva la funció de SFL/CaRAX1/2a, actuant com a repressor de l'activitat del meristem I2. Açò evidencia una conservació funcional entre lleguminoses pròximes i, alhora, una diversificació evolutiva respecte d'espècies amb inflorescències simples, com Arabidopsis. Igualment, el gen homòleg PsRAX1/2b també limita l'activitat del meristem I2. Les plantes mutants psraxb-1 presenten un increment en el nombre de flors per I2, sempre amb una flor terminal anòmala, i mostren un fenotip pleiotròpic que afecta la regulació de la inflorescència i la ramificació. Les nostres dades indiquen que PsRAX1/2b participa en l'establiment de fronteres entre el meristem I2 i els meristems I1 i floral; en la seua absència, aquestes fronteres es perden i l'I2 veu compromesa la seua identitat, generant flors terminals anòmales i estructures vegetatives. L'anàlisi de genotips multibeina revela que el nombre de flors per I2 en pèsol està regulat almenys per quatre gens: PsRAX1/2a (cromosoma 7), PsRAX1/2b (cromosoma 5), Fn (cromosoma 6) i Fna, junt amb Neptune (cromosoma 4). També mostra que aquest caràcter és altament sensible a factors ambientals. Temperatures baixes (18°C) i fotoperíodes de dia curt prolonguen l'activitat del meristem I2 i afavoreixen la formació de més flors, tant en línies multibeina com en genotips de 1-2 flors, encara que amb respostes dependents del genotip. Açò suggereix l'existència de rutes genètiques diferents i subratlla la importància de la plasticitat ambiental en el desenvolupament de la inflorescència. Aquesta influència també s'observa en el silenciament per VIGS de PsRAX1/2a, on sota dia curt i 21°C el fenotip flor doble mostra major expressivitat i penetrança. Finalment, l'anàlisi comparativa en soja resol la controvèrsia sobre la seua arquitectura inflorescent, demostrant que presenta un raïm compost i que la xarxa genètica que defineix la identitat dels meristems (I1, I2 i floral) està conservada respecte a pèsol i Medicago. En particular, Dt2/GmFULc2 exerceix un paper equivalent al del gen VEG1/PsFULc en l'especificació del meristem I2. En conjunt, aquests resultats mostren que la regulació de l'activitat del meristem I2 en lleguminoses depén d'un sistema poligènic amb adaptacions específiques que generen divergència funcional i una marcada resposta a l'ambient. Aquesta visió integradora proporciona un marc conceptual per entendre la regulació del nombre de flors per I2 i estableix les bases per a estratègies de millora orientades a optimitzar el rendiment en cultius de lleguminoses.